做试管郑州哪里做的好：CDC20新突变的鉴定：女性不孕症突变谱的扩展

　　前沿细胞发育生物学》，2021;9:647130

　　1）研究人群：郑州大学苏州城医院第三附属医院生殖医学科和上海交通大学医学院附属第九医院辅助生殖科的465名卵细胞成熟受阻、受精失败或早期胚胎发育停滞的不孕妇女，其DNA从外周血样本中提取。本研究得到了复旦大学医学院伦理委员会和各医院伦理委员会的批准。

　　年龄<45岁，性生活正常，未采取避孕措施1年未怀孕的女性。

　　有2次失败的IVF/ICSI辅助妊娠史，其特征是卵母细胞成熟受阻、受精失败或早期胚胎停育。

　　排除标准。有其他已知不孕原因的妇女，如男性因素、染色体异常、放疗或化疗。

　　2] 基因测序和筛选：使用QIAamp DNA Blood Micro Kit从外周血中提取基因组DNA。使用SeqCap EZ Exome Kit采集全外显子，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序，测序分析与人类参考序列进行比较。使用GRCh37和dbSNP数据库和基因组聚集数据库以及我们内部的外显子组数据库对突变进行注释，并使用SIFT和MutationTaster程序进行功能预测。来自血缘家族的患者被定位为纯合子。根据标准对所有突变候选者进行筛选，并进行Sanger测序以确认先前记录的受影响个体及其父母和兄弟姐妹。

　　TA克隆的构建。杂合突变体的序列从第3家族的前清者的基因组中扩增，并克隆到pClone007载体中。

　　表达载体的构建：从MI阶段的人类卵母细胞的cDNA中扩增出全长的野生型CDC20编码序列并克隆到空的pCMV6载体中。使用KOD-Plus诱变试剂盒诱导点突变。为了进行定位实验，FLAG标签被插入到野生型和突变型载体的c-末端。

　　细胞培养和转染：中国仓鼠卵巢细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的改良EAGLE培养基中培养，并在37℃和5%CO2的加湿培养箱中维持。使用PolyJet体外DNA转染试剂将CDC20野生型和突变型载体转染到CHO细胞。

　　6.蛋白质印迹：在转染前1天将CHO细胞接种到6孔板，然后用1克质粒转染。用含有1%蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。用BCA方法测定蛋白质浓度，等量的蛋白质在10%的SDS-PAGE凝胶上分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5%的脱脂牛奶中密封1小时，并在4℃下与主要抗体孵育过夜。使用稀释度为1:1000的抗CDC20和细胞周期蛋白B1抗体和稀释度为1:3000的抗新蛋白抗体作为内部参考。用山羊抗兔IgG作为第二抗体来检测第一抗体。与二抗孵化后，使用ECL蛋白印迹底物制备最终的蛋白印迹。

　　结果

　　1.临床特征。之前的三个证人都被诊断为原因不明的原发性不孕，尽管月经周期正常，他们的伴侣的精子数量、精子形态和存活率都正常。在IVF/ICSI辅助周期中，观察到反复出现的卵细胞成熟障碍、受精失败和早期胚胎发育障碍。

　　2）识别新的CDC20突变。对纳入的人群进行CDC20突变筛查的测序，发现有4个受影响的个体，分别来自三个独立的家系的纯合子和复合杂合子CDC20突变。

　　第1行：纯合子错义突变c.887G&amp;gt;A。

　　2号线：复合杂合突变，包括错义突变c.965G&amp;gt;a和无义突变c.964C&amp;gt;T。

　　3号线：复合杂合突变，包括错义突变c.1155G&amp;gt;C和剪接突变c.330+1G&amp;gt;A。

　　[3] 新的突变影响CDC20的正常功能。

　　剪接突变c.330+1G&amp;gt;A的影响：琼脂糖凝胶电泳显示，c.330+1G&amp;gt;A与野生型相比有不同大小的条带，较大的条带表明该突变导致的异常的选择性剪接异构体。对该异构体cDNA的序列分析显示，剪接突变c.330+1G&amp;gt;A导致常规剪接位点的缺失，造成内含子2的保留和CDC20蛋白的提前终止。

　　p.Arg296Gln,p.Arg322Gln,p.Trp385Cys和无义突变p.Arg322的影响：在CHO细胞中测定CDC20蛋白水平时，发现错义突变p. 与野生型CDC20相比，Arg296Gln和p.Trp385Cys导致CDC20蛋白水平下降，而错义突变p.Arg322Gln和p.Trp385Cys导致CDC20蛋白水平下降。错义突变p.Arg322导致一个截断的蛋白。错义突变p.Arg322Gln对CHO细胞中的CDC20蛋白水平没有明显的影响，但以前曾有报道说这一突变导致患者淋巴细胞系中的CDC20蛋白水平下降。

　　CDC20突变对细胞周期的影响：CDC20野生型的过量表达导致细胞周期蛋白B1的内源性蛋白水平明显下降，而大多数突变体损害了细胞周期蛋白B1的降解。

　　CDC20突变对CDC20在人体中定位的影响。在动物实验中，带有p.Arg296Gln和p.Trp385Cys错义突变的CDC20表现出与野生型相似的正常有丝分裂定位。相反，p.Arg322无义突变的CDC20未能定位到有丝分裂，这表明CDC20蛋白功能受损。

　　4）CDC20的突变损害了CDC20基因敲除小鼠细胞的表型拯救：以前的研究表明，小鼠细胞的MI阻断表型可以通过注射野生型人类CDC20 cRNA敲除第一极体而得到拯救。在所有突变体中，与野生型CDC20相比，CDC20阻止第一极体射出的能力明显降低。上述结果表明，所有确定的突变都影响CDC20的正常功能。

　　在这项研究中，发现了CDC20的四个新的突变，即c.887G&amp;gt;A、c.964C&amp;gt;T、c.1155G&amp;gt;C和c.330+1G&amp;gt;A，其中大部分突变导致CDC20蛋白水平下降和CyclinB1在CHO细胞中的降解，拼接 c.330+1G&amp；gt；a突变导致蛋白转录异常。这项研究证实了CDC20在人类生殖中的关键作用。

　　[2）不同的CDC20突变在不同的个体中引起不同的表型，包括卵母细胞成熟停止，受精失败和胚胎发育停止。

　　3、多项研究报道了同一基因的不同突变引起的表型差异，这种表型差异的确切机制需要在动物模型中进一步研究。

　　4 在我们以前的研究中，我们发现注射cRNA可以挽救不孕症患者的表型。然而，这种干预的安全性还有待充分评估，未来可能会通过使用转基因小鼠或灵长类动物来进一步探索。

　　由于全外显子组测序的范围有限，本研究只能确定外显子内或附近的单核苷酸变化或小片段插入或缺失，而长片段插入和缺失、拷贝数变异和非翻译区的突变则无法检测。

　　本研究发现了CDC20中三个新的双等位基因突变，导致女性不孕。这扩大了CDC20的突变谱，并提供了一个女性不孕症的遗传诊断标志物。

　　郑州大学第三附属医院生殖科研究生。

　　硕士，郑州大学第三附属医院生殖医学科胚胎学实验室的胚胎学家。

　　毕业于北京大学医学院基础医学院组织胚胎学系，从事生殖调节领域的研究。她在胚胎学实验室工作了8年，对胚胎学实验室有丰富的了解，掌握了胚胎学实验室的所有手术技巧。

　　他是河南省医学会低温医学分会第一届青年委员会的青年委员。

　　他主持了河南省医学科技联合项目。

　　参与多项临床研究项目和其他研究项目，发表多篇中文和专业文章。

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